沉淀反应_百度文库

作者:浙江体彩网 | 2020-04-08 23:12

  沉淀反应_生物学_自然科学_专业资料。沉淀反应 沉淀反应特点: 沉淀反应是指可溶性抗原和相应抗体在特定的条件下特异性结合所出现的沉淀现象。 沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素、核酸等可溶性的小分子物质。 一、 概念 可溶性

  沉淀反应 沉淀反应特点: 沉淀反应是指可溶性抗原和相应抗体在特定的条件下特异性结合所出现的沉淀现象。 沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素、核酸等可溶性的小分子物质。 一、 概念 可溶性抗原与其相应抗体特异结合,出现肉眼可见的免疫复合物,称为沉淀反应。沉淀反应 属于体外抗原抗体反应,其反应也分两个阶段:第一阶段位抗原抗体发生特异性结合,几秒 到几十秒即可完成,出现可溶性小复合物,肉眼不可见;第二阶段为形成大的可见免疫复合 物,如沉淀线、沉淀环等。 二、 液相内的沉淀反应 液相内的沉淀反应类型有絮状沉淀反应、环状沉淀反应和免疫浊度试验。 1、 絮状沉淀反应 在电解质溶液中,可溶性抗原与相应抗体特异性结合,当抗原和抗体 分子比例合适的时,可形成絮状或颗粒状的不溶性沉淀物。直接影响絮状沉淀的试验最 重要的因素是抗原和抗体分子比例合适。 ① 抗原稀释法 抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗体反应 ② 抗体稀释法 抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应 ③ 方阵滴定法 方阵滴定法即棋盘滴定法 (二维的,既稀释抗原也稀释抗体) 2、 环状沉淀反应 先将适量已知抗血清价值毛细玻璃管(2~3mm)底部,再沿管壁缓缓 加入等体积待测样品溶液,使样品与抗血清分层清晰。如果样品中有与已知抗体对应的 可溶性抗原,会在两种液体的交界面出现白色沉淀环。 3、 免疫浊度试验 ⑴原理:在特殊缓冲液中,分子比例合适的可溶性抗原与相应抗体形成抗原抗体复合物,使 反应液出现浑浊, 其浊度与免疫复合物的量成正比, 利用光学测量仪器结合自动分析检测系 统检测,并与一系列的标准品对照,即可计算出被检抗原或抗体的含量。 免疫浊度法按照仪器设计的不同,分为使用透射比浊仪的免疫透射比浊法和使用散射 比浊仪的免疫散射法。 免疫浊度法可用于液体中的微量抗原、抗体及小分子半抗原(如药物等)的定量检测。 其优点是自动检测、操作简便快速、适合大批量标本检测、灵敏度高(可达毫微克水平) 、 且无放射性污染。 A、免疫透射比浊法原理及用途:当抗原抗体特异结合形成 IC 时,溶液浊度增加。到一定 波长的光线通过此溶液时,由于溶液中 IC 吸收光而导致透光量减少,利用透射比浊仪测量 出溶液的入射光衰减,求得的溶液吸光度(A)可用于表示浊度。在一定范围内 A 值与 IC 值成正相关,若固定抗体量,则根据 A 值可以推算出抗原的量。 免疫透射法快速,检测可进行自动化,常用于临床体液蛋白的检测。 B、免疫散射比浊法原理及用途:当光束沿水平轴照射被检溶液时,碰到小颗粒的 IC 可导 致光线偏转(光散射) ,用散射比浊仪可测定溶液散射光强度(I) 。当入射光波长固定时,I 值与 IC 值量成正比, 即形成的 IC 越多散射光强度越强。 免疫散射比浊法又分为速率散射比 浊法和终点散射比浊法。 C、免疫胶乳浊法原理及用途:将抗体吸附于胶乳颗粒表面,当与抗原结合时,胶乳颗粒发 生凝聚,使透过光减少,吸光度值与胶乳凝聚物的两成正相关。根据标准曲线即可得知待测 标本抗原含量。 ⑵直接影响浊度试验最重要的因素是 ①抗原和抗体分子比例合适。 当反应液中抗原过量时,形成的 IC(免疫复合物)分子小,而且会发生再解离,使浊度反 而下降,光散射亦减少,这就是高剂量钩状效应。 当反应液中抗体过量时,IC 的形成随着抗原递增而增加至抗原、抗体最适比例处达最高峰, 这就是经典的海德堡曲线理论。 ②抗体的质量 免疫比浊法要求抗体的特异性强、效价高、亲和力强、并使用 R 型抗体(rabbit 来源兔子, 量少,一般用于诊断;与之相对应的事 H 型抗体,horse 来源于马的抗体,量大,一般用 于免疫的治疗) ④ 抗原抗体反应的溶液 抗原抗体反应液的最适 PH 值为 6.5~8.5,一般常用 PBS 磷酸盐缓冲液作为免疫比浊法的反 应液 ⑤ 增浊剂 某些非离子型亲水剂对促进 IC 的形成有显著地增强作用,如聚乙二醇(PEG) 、吐温-20 其作用是消除蛋白质(抗原或抗体)分子周围的电子云和水化层,促进抗原抗体分子靠近, 结合形成大分子复合物。 三、 凝胶内沉淀试验(固体内) 凝胶内沉淀试验是利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散, 形成浓度梯度, 在抗原与抗体 浓度比例合恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 凝胶的支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)等(前两者颗粒 较大,分辨率较低,适合检测颗粒较大的抗原抗体复合物,后两者反之。 ) 凝胶内沉淀反应类型有单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验。 1、 单向琼脂扩散试验 是在琼脂凝胶内混入抗体, 待测抗原从局部向琼脂凝胶内自由扩 散,如抗原和抗体特异结合,则可在分子比例合适处形成沉淀环。 ⑴试管法:将一定量的抗体均匀混入约 50℃的 0.7%琼脂糖溶液中,注入小试管内,待琼脂 糖冷却凝固后,在凝胶上层加抗原溶液,使待测抗原向下在凝胶中自由扩散,在抗原抗体分 子比例恰当的位置形成沉淀环。 (少用) ⑵平板法:将一定量的抗体均匀混入月 50℃的 0.9%琼脂糖溶液中,迅速倾注在平板玻片上 使其冷凝为凝胶板。在此凝胶板上打孔,在孔中加入待测抗原,当抗原从孔内向外自由扩散 时,如能和琼脂胶中的相应抗体特异结合,24~48h 后则可形成沉淀环。沉淀环直径与抗原 浓度成正比,测定环的直径即可根据标准曲线计算标本中待测抗原的浓度。 ①Mancini 曲线 适用于大分子抗原和长时间扩散(48h)的结果,沉淀环的直径的平方 与抗原浓度呈线性关系 ②Fahey 曲线 适用于小分子抗原和较短时间扩散的结果处理,用半对数纸画线,浓度 对数与扩散环直径呈线性关系。 影响因素 ①抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强,在良好条件下保存 ②每次测定都必须作标准曲线 ③每次测定时必须用质控血清作质控 ④注意双环现象(出现了两种抗原性相同成分) ⑥ 应用单克隆抗体测量多态性抗原时,测定值偏低;用多克隆抗体测量单克隆病时,测定 值偏高。 2、双向扩散试验 双向扩散试验是让抗原和抗体双方都在琼脂中各自向对方扩散, 在比例恰当之处形成抗原抗 体沉淀线,观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系,可对抗原或抗体进行定性分析。 ① 试管法:在试管中,先加入含已知抗体的琼脂糖凝胶,凝固后再加一层普通琼脂,最后 加入含有可溶性抗原的溶液,让下层抗体和上层抗原向中间琼脂凝胶层中自由扩散,在 抗原与抗体分子比例合适处形成沉淀环。 ② 平板法:是检测抗原抗体的最基本、最常见的方法之一。 在琼脂板上相距适当地打一对孔(或者梅花孔、双排孔、三角孔等) ,在孔中分别加入可 溶性抗原或抗体放置湿盒 37℃18~24h 后,当两者自由扩散区域相交时可特异性结合,在抗 原抗体分子比例合适处可成肉眼可见的沉淀线。 根据沉淀先的位置可作如下分析: A、 抗原性质分析:特异性相对应的一对抗原与抗体只能形成一条沉淀线,两条沉 淀线如果完全平滑吻合,可判定两种抗原同一,如不吻合可判定非同一,若部 分吻合则判定为两种抗原部分成分相同。 B、 分析抗原或抗体的相对分子量:两孔间沉淀弧一般弯向分子量大的蛋白质一方, 若为直线,说明抗原与抗体分子量非常接近或相等。 C、 推测抗原或抗体相对含量:一般情况下,沉淀线靠近抗原孔提示抗体量大,沉 淀线靠近抗体孔则提示抗原量大。不出现沉淀线则表明无相对应的抗原或抗体 或者抗原过量 D、 测定抗体效价:不同浓度抗体与定量抗原双向自由扩散(抗体稀释法、抗原稀 释法、棋盘法) ,出现抗原抗体沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。


浙江体彩网